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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：DNA的酶切與連接
更新時(shí)間：2013-08-02 瀏覽次數(shù)：1730
利用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA是DNA重組過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一。成功的酶切和有效的連接為后續(xù)的外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)提供了有效的實(shí)驗(yàn)材料。
實(shí)驗(yàn)方法
- 質(zhì)粒DNA酶切
- DNA段連接
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 限制性內(nèi)切酶能夠特異性地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 標(biāo)準(zhǔn)pUC19（2686bp） |
| 試劑、試劑盒 | EcoRI及其配套的酶切緩沖液 0.5×TBE電泳緩沖液 6×Loading Buffer Goldview 瓊脂糖 |
| 儀器、耗材 | 水平電泳儀 水浴鍋 移液器 微波爐 成像設(shè)備 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1.在200ul的離心管中，按照下表加入試劑（單位：ul），混勻；點(diǎn)動(dòng)離心將反應(yīng)液甩至管底。37℃保溫2h進(jìn)行酶切反應(yīng)。  2.反應(yīng)結(jié)束后，加入2ul 10×Loading Buffer鈍化酶活性；（或：65℃，保溫20min使酶失活）。 3.電泳檢測(cè)。 酶切陰性對(duì)照：pUC19標(biāo)樣+10×Loading Buffer 2ul 酶切樣品：標(biāo)準(zhǔn)pUC19酶切樣品10ul + 10×Loading Buffer 2ul 4.質(zhì)粒及酶切樣品電泳預(yù)期結(jié)果。  |
| 注意事項(xiàng) | 影響酶切的因素：在酶切反應(yīng)中，DNA的純度、緩沖液中的離子強(qiáng)度、Mg2+等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過(guò)增加酶的用量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施以達(dá)到*酶切。但應(yīng)注意的是，過(guò)多的酶量和過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間會(huì)造成非特異性的酶切（星號(hào)活性） |